Spektrofluorymetria zmienia standardy kontroli jakości leków przeciwhistaminowych

Czy nowatorska spektrofluorymetria zmieni kontrolę jakości leków?

Innowacyjna metoda oznaczania bilastyny – przełom w kontroli jakości leków przeciwhistaminowych

Bilastyna (BIL) to stosunkowo nowy lek przeciwhistaminowy drugiej generacji, stosowany doustnie w leczeniu objawów pokrzywki oraz sezonowego lub przewlekłego zapalenia błony śluzowej nosa i spojówek. Lek został zatwierdzony przez Europejską Agencję Leków (EMA) we wrześniu 2010 roku. Naukowcy opracowali innowacyjną metodę spektrofluorymetryczną do oznaczania bilastyny, która może zrewolucjonizować sposób kontroli jakości tego leku w preparatach farmaceutycznych i próbkach biologicznych.

Bilastyna wykazuje wysokie powinowactwo do receptorów H₁ oraz niewielkie lub zerowe powinowactwo do innych receptorów, w tym niektórych podtypów receptorów histaminowych, muskarynowych i receptorów 5-HT. Dzięki temu nie wywołuje efektów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Co istotne, powinowactwo bilastyny do receptorów H₁ jest 6-krotnie wyższe niż feksofenadryny i 3-krotnie wyższe niż cetyryzyny. Czy ta wysoka selektywność przekłada się na lepszą skuteczność kliniczną? Pytanie to pozostaje otwarte dla klinicystów stosujących różne leki przeciwhistaminowe.

Czy spektrofluorymetria to odpowiedź na ograniczenia tradycyjnych metod?

Struktura chemiczna bilastyny to 2-[4-(2-(4-(1-(2-etoksyetylo)-1H-benzimidazol-2-ylo)piperydyn-1-ylo)etylo)fenylo]-2-metylopropionowy kwas. Związek ten zawiera pierścień benzimidazolowy, który odpowiada za wysoką intensywność fluorescencji bilastyny, co stanowi podstawę opracowanej metody analitycznej.

Dotychczas opublikowano różne metody analizy bilastyny, w tym spektrofotometryczne, fluorometryczne, HPLC, chromatografię cienkowarstwową (HPTLC), spektroskopię w bliskiej podczerwieni i metody elektrochemiczne. Jednakże techniki HPLC wymagają dużych ilości bardzo czystych rozpuszczalników organicznych, długiego czasu przygotowania próbek, skomplikowanej aparatury i czasami bardzo drogich detektorów. Z kolei metody spektrofotometryczne mają ograniczoną czułość, a w jedynej opublikowanej metodzie spektrofluorymetrycznej występuje znaczący efekt filtra wewnętrznego (IFE), który ogranicza liniową zależność sygnału fluorescencji od niskich stężeń próbki.

Jak zoptymalizować pomiary spektrofluorymetryczne bilastyny?

Nowa metoda wykorzystuje właściwości fluorescencyjne bilastyny w środowisku kwasu siarkowego. “Nasze badania wykazały, że zastosowanie kwasu siarkowego przesuwa długości fal wzbudzenia i emisji do 272 nm i 385 nm. W rezultacie efekt filtra wewnętrznego został zminimalizowany, co umożliwiło oznaczanie w szerokim zakresie stężeń” – piszą autorzy badania. Opracowana metoda ma liczne zalety: niższy koszt, niską toksyczność, prostotę, szybkość działania oraz jest przyjazna dla środowiska dzięki wykorzystaniu wody jako rozpuszczalnika.

Pomiary spektrofluorymetryczne przeprowadzono za pomocą spektrofluorometru JASCO FP-8350 wyposażonego w lampę ksenonową o mocy 150 W i fotopowielacz ustawiony na napięcie 400 V. Szerokość szczelin dla monochromatorów emisji i wzbudzenia ustawiono na 5 nm, a szybkość skanowania wynosiła 1000 nm na minutę. Aby zapewnić dokładność i wiarygodność pomiarów fluorescencji, długość fali spektrofluorometru kalibrowano regularnie przy użyciu roztworu siarczanu chininy (0,1 μg/ml w 0,1 M H₂SO₄), który ma znane maksimum emisji przy 450 nm po wzbudzeniu przy 350 nm.

Procedura badania była prosta i polegała na przeniesieniu roztworów standardowych bilastyny o stężeniach od 0,1 do 5 μg/ml do 10 ml kolb miarowych, a następnie dodaniu 2 ml 1 M kwasu siarkowego. Kolby uzupełniano do końcowej objętości wodą destylowaną, a zawartość dokładnie mieszano. Intensywność fluorescencji powstałych roztworów monitorowano przy 385 nm (λₑₓ przy 272 nm).

Czy walidacja potwierdzi niezawodność metody?

Badacze przeprowadzili szczegółową walidację metody zgodnie z wytycznymi Międzynarodowej Rady ds. Harmonizacji (ICH). Wyniki potwierdziły, że metoda charakteryzuje się doskonałą liniowością w zakresie stężeń od 10 do 500 ng/ml, z współczynnikiem korelacji 0,9999. Granica wykrywalności (LOD) wyniosła zaledwie 2,9 ng/ml, a granica oznaczalności (LOQ) 8,8 ng/ml, co potwierdza wysoką czułość metody. Dokładność i precyzja metody zostały potwierdzone poprzez analizę różnych stężeń bilastyny, a wszystkie wartości względnego odchylenia standardowego były poniżej 2%, co świadczy o doskonałej precyzji.

Dokładność metody oceniono również za pomocą metody dodatku wzorca. Do 1 ml wcześniej analizowanych próbek bilastyny (500 ng/ml) uzyskanych z tabletek Contrahistadin® 20 mg dodano 1 ml trzech różnych stężeń (500, 1500 i 2500 ng/ml) roztworu wzorcowego bilastyny. Analizę przeprowadzono dla każdego stężenia, stosując ogólną procedurę analityczną w pięciu powtórzeniach, co potwierdziło wysoką dokładność metody.

Badacze sprawdzili również odporność metody na małe zmiany parametrów. Jedynym parametrem, który można było zbadać, była objętość kwasu siarkowego. Niewielkie zmiany objętości kwasu siarkowego nie miały widocznego wpływu na wydajność metody. Gdy dodano 1,5 ml kwasu siarkowego, odzysk ± SD (średnia z pięciu oznaczeń) wynosił 98,23 ± 0,44, a gdy dodano 2,5 ml kwasu siarkowego, odzysk ± SD wynosił 98,02 ± 0,51. Tym samym proponowana metoda fluorometryczna okazała się odporna na niewielkie zmiany warunków.

Czy wysoka selektywność metody gwarantuje bezpieczeństwo preparatów?

Jednym z najważniejszych aspektów nowej metody jest jej selektywność. Badacze sprawdzili wpływ różnych substancji pomocniczych stosowanych w produkcji tabletek, takich jak talk, tlenek cynku, stearynian magnezu, laktoza, glukoza i skrobia. Wyniki wykazały brak jakiegokolwiek wpływu tych substancji na proponowaną metodę, co potwierdziło jej wysoką selektywność. Jakie znaczenie ma to dla lekarzy i farmaceutów? Przede wszystkim gwarantuje wiarygodność wyników analiz leków, co przekłada się na bezpieczeństwo pacjentów.

Metoda została z powodzeniem zastosowana do analizy bilastyny w preparacie farmaceutycznym (tabletki Contrahistadin®). Co więcej, po raz pierwszy metoda spektrofluorymetryczna została wykorzystana do badania jednorodności zawartości (CU) bilastyny w tabletkach komercyjnych. Jest to istotne, ponieważ zgodnie z zaleceniami farmakopealnymi, jeśli proporcja składników aktywnych w jednostkach formulacji tabletek nie przekracza 25% całkowitej masy tabletki lub jeśli zawartość składnika aktywnego jest mniejsza niż 25 mg, należy zbadać jednorodność zawartości jednostek tabletek.

Test jednorodności zawartości (CU) dla bilastyny w formulacji tabletki przeprowadzono zgodnie z wymaganiami USP (rozdz. 905). Przeprowadzono oddzielną analizę dziesięciu tabletek Contrahistadin® 20 mg w celu sprawdzenia jednorodności ich zawartości. Każdą tabletkę dokładnie zważono i drobno sproszkowano. Porcję drobnego proszku zawierającego 10,0 mg bilastyny przeniesiono do 100 ml kolby miarowej zawierającej 30 ml wody podwójnie destylowanej i zawartość sonikowano przez 30 minut. Kolbę uzupełniono do końcowej objętości wodą destylowaną, aby uzyskać roztwór 100 μg/ml bilastyny. Następnie obliczono wartość akceptacyjną (AV) zgodnie z równaniem: AV = KS + |M – X̄|, gdzie S oznacza odchylenie standardowe, K oznacza stałą akceptowalności, M oznacza wartość odniesienia, a X̄ to średnia zawartość każdej tabletki. Jeśli AV była niższa lub równa maksymalnej dopuszczalnej wartości akceptacyjnej (L1) 2,4, stwierdzono, że ilość składnika aktywnego jest jednorodna.

Jak skutecznie oznaczyć bilastynę w osoczu?

Kolejnym istotnym zastosowaniem metody jest możliwość oznaczania bilastyny w osoczu ludzkim. Jak wiadomo, bilastyna osiąga maksymalne stężenie w osoczu (Cmax = 220 ± 62 ng/ml) 1,3-1,5 godziny po podaniu doustnym. Lek ma wysoki wskaźnik wiązania z białkami osocza (84-90%), a około 95% bilastyny wykrywa się w osoczu w postaci niezmienionej. Bilastyna nie jest metabolizowana w znacznym stopniu u ludzi i jest prawie całkowicie usuwana z organizmu w postaci niezmienionej przez nerki (33%) i kał (67%). Ze względu na wysoką czułość opracowanej metody, możliwe było oznaczenie bilastyny w płynach biologicznych z odzyskiem w zakresie 95,72-97,24%.

Procedura oznaczania bilastyny w wzbogaconym osoczu ludzkim była następująca: w celu oddzielenia białek osocza, próbkę krwi o objętości 5 ml odwirowano przy 4000 obr/min przez 30 minut. Uzyskane osocze umieszczono w probówkach Eppendorfa i przechowywano w temperaturze -20°C. Do czystej probówki przeniesiono 1,0 ml przechowywanego osocza, dodano 1,0 ml roztworu standardowego bilastyny (końcowe stężenia 0,1-5 μg/ml), a następnie dodano 2,0 ml acetonitrylu jako czynnika strącającego białka. Probówkę mieszano na wytrząsarce przez 60 sekund, a następnie wirowano przez 10 minut przy 4000 obr/min. Czysty supernatant przeniesiono do czystej probówki i zastosowano ogólną procedurę metody.

Czy metoda jest przyjazna dla środowiska?

Warto podkreślić, że opracowana metoda jest również przyjazna dla środowiska. Ocena ekologiczności metody oparta na eko-skali, która generuje liczbową reprezentację odzwierciedlającą kary poniesione podczas procesu badawczego, wykazała, że metoda otrzymała godny uwagi wynik 95 punktów na eko-skali, jednoznacznie potwierdzając jej ekologiczny charakter. Opracowana metoda wymagała mniej niż 0,1 kW/h energii do przetworzenia pojedynczej próbki, eliminując potrzebę ogrzewania lub fazy ekstrakcji.

Jakie są perspektywy dalszych badań?

Podsumowując, zaproponowana metoda spektrofluorymetryczna jest wysoce selektywna do oznaczania formulacji tabletek bilastyny bez interferencji z ich substancjami pomocniczymi. Jest ona czuła, dokładna i precyzyjna w analizie tego leku przeciwhistaminowego zarówno w czystej postaci, jak i w komercyjnych preparatach tabletkowych. Prosta procedura metody umożliwiła jej zastosowanie w badaniu jednorodności zawartości tabletek. Dzięki dobrej czułości metoda pozwala również na analizę bilastyny w wzbogaconym osoczu ludzkim. Jest to metoda oszczędzająca czas, eliminująca żmudne kroki przygotowania próbki lub ekstrakcji. Ze względu na swoją prostotę i czułość, metoda ta jest doskonałym kandydatem do kontroli jakości bilastyny. Zastosowanie wody destylowanej jako zielonego rozpuszczalnika sprawia, że proponowana procedura jest dobrą alternatywą dla konwencjonalnych metod wykorzystujących szkodliwe rozpuszczalniki organiczne.

Czy ta innowacyjna metoda znajdzie szerokie zastosowanie w laboratoriach kontroli jakości i badaniach klinicznych? Czy może przyczynić się do lepszego monitorowania terapii bilastyną u pacjentów? Odpowiedzi na te pytania przyniesie przyszłość, ale już teraz można stwierdzić, że stanowi ona istotny krok naprzód w dziedzinie analityki farmaceutycznej.

Podsumowanie

Opracowano innowacyjną metodę spektrofluorymetryczną do oznaczania bilastyny – leku przeciwhistaminowego drugiej generacji. Metoda wykorzystuje właściwości fluorescencyjne bilastyny w środowisku kwasu siarkowego, co pozwala na precyzyjne pomiary przy długościach fal wzbudzenia 272 nm i emisji 385 nm. W porównaniu do tradycyjnych technik analitycznych, nowa metoda charakteryzuje się wysoką czułością (LOD 2,9 ng/ml), doskonałą liniowością w zakresie 10-500 ng/ml oraz precyzją poniżej 2% RSD. Szczególnie istotna jest jej selektywność – substancje pomocnicze stosowane w produkcji tabletek nie wpływają na wyniki analiz. Metoda została skutecznie zastosowana do badania jednorodności zawartości tabletek oraz oznaczania bilastyny w osoczu ludzkim, z odzyskiem 95,72-97,24%. Jest przyjazna środowisku (95 punktów na eko-skali), ekonomiczna i szybka w wykonaniu, co czyni ją atrakcyjną alternatywą dla konwencjonalnych metod analitycznych.